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多色免疫熒光染色試劑盒使用說明
酪酰胺信號放大(TSA,Tyramide signal amplification)技術(shù)是一類利用辣根過氧化酶(HRP)對靶蛋白進行標記的酶學(xué)檢測方法,類似常規(guī)免疫組化的DAB顯色方法 ,TSA技術(shù)同樣采用HRP標記的二抗,同樣有對應(yīng)的“顯色"步驟(HRP催化加入反應(yīng)體系的酪胺熒光素底物,產(chǎn)生活化熒光底物,活化底物可與抗原上的酪氨酸等殘基共價結(jié)合,使樣品上穩(wěn)定的共價結(jié)合酪胺熒光素。之后用熱修復(fù)法洗去非共價結(jié)合的一抗-二抗-HRP復(fù)合物,重復(fù)下一種一抗-hrp二抗來第二輪孵育,換另一種酪胺熒光素底物,如此往復(fù)就可實現(xiàn)多重標記。
TSA詳細原理是利用酪胺Tyramide的過氧化物酶反應(yīng)(酪胺鹽在HRP催化H202下形成共價鍵結(jié)合位點),產(chǎn)生大量的酶促產(chǎn)物,該產(chǎn)物能與周圍的蛋白殘基(包括色氨酸、組氨酸和酪氨酸殘基)結(jié)合,這樣在抗原-抗體結(jié)合部位就有大量的熒光素沉積,結(jié)果使其檢測信號得到10-100倍增強。簡單來說,用這種方法做多重免疫熒光是利用二抗上帶有的HRP(而不是直接偶聯(lián)熒光素),來催化后續(xù)添加入體系的非活性熒光素。熒光素在HRP和過氧化氫的作用下被活化,跟臨近蛋白的酪氨酸殘基共價偶聯(lián),使得蛋白樣品與熒光素穩(wěn)定結(jié)合。然后微波或煮沸或者水浴等熱修復(fù)處理,前一輪非共價結(jié)合的抗體被洗掉,共價結(jié)合的熒光素穩(wěn)定共價結(jié)合在樣本切片蛋白上。再換個一抗來第二輪孵育,周而復(fù)始。等到所有抗體孵育結(jié)束,熒光素都結(jié)合好后,最后去檢測結(jié)果。由于每次體系中都只有單一抗體孵育,因此無需擔(dān)心抗體交叉反應(yīng),以及一抗二抗種屬匹配問題,大大減少了實驗設(shè)計時不同種屬抗體選擇匹配的限制。也就是說,如果用TSA技術(shù),同一張片子上所有的靶標都可以選用特異性高的兔單克隆抗體。搭配同一支抗兔的HRP二抗就可以進行實驗,而且信號放大的倍數(shù)大大增強。茹創(chuàng)生物開發(fā)的試劑盒具體酪胺熒光染料為以下其中一種或者多種:TYR-480,TYR-520,TYR-570,TYR-620,TYR-690,TYR-780。此試劑盒中的熒光染料可單獨或配合使用??梢詫崿F(xiàn)單標、雙標、三標以及更多重?zé)晒夥糯?多重同源抗體熒光標記等功能,豐富了此試劑盒的內(nèi)涵。
多色免疫熒光染色試劑盒使用說明 試劑盒組成:
產(chǎn)品名稱規(guī)格保 存?zhèn)渥?/p>
TYR-520熒光染料(綠光)(即用型)5mL-20℃TYR-520熒光染料 、TYR-570熒光染料 、TYR-690熒光染料 在-20度下 ,均為固體,使用之前需解凍。
TYR-570熒光染料(紅光)(即用型)5mL-20℃
TYR-690熒光染料(即用型)5mL-20℃
TSA+增強劑100ul-20℃(可選)
高敏多聚hrp山羊抗兔二抗5mL4℃
TSA+增強劑使用方法:TSA+增強劑能夠進一步增強熒光信號放大液的放大信號5-10倍,TSA+增強劑:TYR熒光放大液=1:500,使用TSA+增強劑不是必須的選項,可以根據(jù)具體的情況選擇添加或者不選擇添加。
多色免疫熒光染色試劑盒使用說明操作流程:
1、 石蠟切片脫蠟至水:依次將切片放入二甲benⅠ15min-二甲benⅡ15min-無水乙醇Ⅰ5min-無水乙醇Ⅱ。取出放在通風(fēng)廚內(nèi),酒精晾干后放入自來水中稍洗,蒸餾水洗。
2、 抗原修復(fù):組織切片置于盛滿PH 9.0 EDTA堿性抗原修復(fù)液或者PH6.0檸檬酸修復(fù)緩沖液的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)進行抗原修復(fù)(也可以用高壓1-2min 100度水煮15min 95度水浴20min等其他熱修復(fù)方法)。中火8min,停火8min,轉(zhuǎn)中低火7min,此過程中應(yīng)防止緩沖液過度蒸發(fā),切勿干片。自然冷卻后將玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次,每次5min。(修復(fù)液和修復(fù)條件根據(jù)組織類型以及抗原類型來確定)。
3、 阻斷內(nèi)源性過氧化物酶:切片放入3%過氧化氫溶液,室溫避光孵育15 min,將玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次,每次5min。
4、 BSA封閉:切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈(防止抗體流走),在圈內(nèi)滴加用3%BSA-PBS(或者其他封閉液)均勻覆蓋組織,室溫封閉30min。
5、 加一抗:輕輕甩掉封閉液,在切片上滴加用抗體稀釋液稀釋好的的一抗X,切片平放于避光濕盒內(nèi)4°C孵育過夜或者37度1-2h。(濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā))
6、 加hrp二抗:玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次,每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的hrp二抗覆蓋組織,避光室溫孵育50min,PBS洗三次。
7、 熒光染料反應(yīng):TYRXXX熒光染料反應(yīng)10-15min,PBS洗三次。
8、 重復(fù)2-7步驟(換用另外一種TYRXXX熒光染料)
9、 DAPI復(fù)染細胞核:玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次,每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加DAPI染液,避光室溫孵育10min。
10、 封片:玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次,每次5min。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。
11、 鏡檢拍照:切片于熒光顯微鏡/共聚焦/多通道熒光掃描儀/多光譜成像系統(tǒng)下觀察并采集圖像。
染料激發(fā)波長發(fā)射波長
DAPI 藍色350420
TYR-480450480
TYR-520綠色490520
TYR-570紅色550570
TYR-620590620
TYR-690630690
TYR-780750780
文章引用試劑盒/方法:Co-staining of A, B and C was performed using a Four-color Fluorescence kit (Guduo Biological Technology, Shanghai, China) based on the tyramide signal amplification (TSA) technology according to the manufacture’s instruction.
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