服務熱線
15502280048
攻克ELISA實驗,需要搞定那些問題呢?
ELISA是蛋白定量的金標準,也是免疫學研究中常用的實驗方法之一。很多人覺得ELISA很簡單,其實不然。本生生物帶你了解ELISA實驗中出現(xiàn)的各種問題。
酶聯(lián)免疫吸附實驗
酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)用于:
(1)免疫酶染色各種細胞內(nèi)成份的定位;
(2)研究抗酶抗體的合成;
(3)顯現(xiàn)微量的免疫沉淀反應;
(4)定量檢測體液中抗原或抗體成份。
優(yōu)點:快速、靈敏、定性、定量、定位
實驗原理
1.包被:抗原/抗體,固相化
2.反應: 1)待測抗體/抗原; 2)酶標抗原/抗體
3.洗滌:使結合在固相上的抗原抗體復合物與未結合的分離
4.底物顯色:定性/定量分析
常用的酶與底物:
酶底物顯色測定波長辣根過氧化物酶 xidase,HRP鄰b二胺(OPD)橘紅色492nm四甲基聯(lián)b胺(TMB)黃色450nm堿性磷酸酶alkaline phosohatase,AP4-硝基酚磷酸鹽(p-NPP)黃色405nm終止液:2mol/L H2SO4
常用方法
1.間接法
檢測抗體的方法, 主要用于對病原體抗體的檢測。
優(yōu)勢:二抗可以加強信號,而且有多種選擇能做不同的測定分析。不加酶標記的一級抗體則能保留它最多的免疫反應性。
缺點:交互反應發(fā)生的機率較高
2.雙抗體夾心法
檢測大分子抗原常用的方法。
優(yōu)勢:高靈敏、高專一性,抗原無須事先純化。
缺點:抗原一定得擁有兩個以上的抗體結合部位。
3.競爭法
檢測小分子半抗原(藥物、激素等)。
優(yōu)勢:可適用比較不純的樣本,而且數(shù)據(jù)再現(xiàn)性很高。
缺點:整體的敏感性和專一性都較差。
常見問題分析
Q1.標曲不顯色或顯色很弱,樣本顯色
溶解標準品以及倍比稀釋時,未渦旋震蕩或不夠充分。
標準品溶解、倍比稀釋時均需要渦旋震蕩以保證充分混勻。單純依靠移液器反復吹打,效率較低、效果也不一定最佳。
Q2.標曲和樣本均不顯色
在孵育階段靜置在桌面上,這樣非常不利于抗原抗體之間的充分接觸,導致顯色偏弱。
推薦孵育階段,使用ELISA專用的微孔板振蕩器,調(diào)至合適的頻率,使抗原抗體充分接觸,保證結合效果。如果排除上述原因,有可能是漏加了某個組分,如檢測抗體、酶等。對于比較馬虎的新手,一定要做好標記和記錄,或者使用添加染料的ELISA試劑盒。
Q3.標曲顯色,樣本不顯色
當樣本中目的蛋白濃度極低或者樣本中干擾因素較強,就無法檢測到。目前ELISA仍然是蛋白檢測靈敏度最高的方法,與不同技術結合后,衍生出了多種類型的ELISA,提高了檢測靈敏度。
對于目的蛋白濃度特別低的樣本,可以嘗試用高敏ELISA,但這也并不意味著一定能檢測到樣本濃度,只能說可以提高樣本的可測率,并使結果更加可靠。因為通常用普通ELISA檢測的樣本OD值都偏低,而高敏ELISA可提高樣本OD值,使之盡量位于標曲范圍內(nèi),得到的數(shù)值也更加可信。
Q4.標曲和樣本都顯色,但復孔的CV大
這個問題就跟移液器和實驗者的操作有關了。移液器的使用維護不規(guī)范,就會造成移液的誤差較大;實驗者自身的操作習慣、加樣的一致性對復孔的CV也有很大影響。
掌握移液器的正確使用和維護。關于個人的操作可練習移液動作、加快速度,確保移液的精密度。
Q5.本底偏高,樣本值測不到
標曲的本底即Blank孔的OD值一般要求控制在0.1以下(對于高敏ELISA可以適當放寬要求)。尤其是樣本值特別低的時候,本底過高會掩蓋目的信號,導致無法測到樣本值。
在加入TMB顯色后,需實時觀察標曲顯色情況。通常在S5孔有肉眼可見的微弱藍色,即可終止反應。
Q6.樣本經(jīng)不同梯度稀釋,計算得到的樣本值差異較大
有時候我們不清楚樣本中目的蛋白的濃度如何,應該如何稀釋,那么我們就會做下預實驗,確定稀釋倍數(shù)。然而有時候同一樣本做了幾個不同梯度稀釋后,計算得到的樣本值之間差異較大,應該選擇哪一個稀釋倍數(shù)呢?
這里涉及到了基質(zhì)效應。通常血清樣本加樣量較高時,血清中的各種蛋白會抑制抗原抗體的接觸,基質(zhì)效應較明顯。而經(jīng)過稀釋后,干擾因素也隨之稀釋,影響就會較小。當某兩個梯度稀釋后,計算得到的樣本值接近時,我們就可以認為在該稀釋梯度時,樣本中的干擾因素影響較小,計算得到的值也是接近真實的。然而這樣的稀釋是針對目的蛋白濃度較高的樣本而言。對于濃度很低的樣本,經(jīng)過多倍稀釋后,就更加測不到了,此時可按照廠家說明書推薦的加樣方式操作。
Q7.不同試劑盒中的組分能否通用
除非是公用的試劑如洗液、檢測緩沖液,其它組分不建議用其它試劑盒的組分,甚至是同一指標不同批次的試劑盒里的組分。這些組分(包括標準品、標準品稀釋液、檢測抗體、酶等)都是經(jīng)過優(yōu)化的,如果貿(mào)然使用其它試劑盒的組分,有可能對結果產(chǎn)生影響。
elisa試劑盒本生一直視質(zhì)量控制為企業(yè)的生命,追求企業(yè)競爭力的不斷提升。公司在經(jīng)營中始終秉承:遵紀守法,嚴于律己,寬仁以待,敢于承擔的企業(yè)精神作為標準,以過硬的質(zhì)量和優(yōu)良的服務來維護和拓展市場,較大限度的滿足客戶的需求。與客戶的共贏,是我們的發(fā)展目標。本生!您信任的合作伙伴。我們愿與您真誠合作,共創(chuàng)美好的未來。
如果您有任何問題,請跟我們聯(lián)系!
聯(lián)系我們
版權所有©2024 本生(天津)健康科技有限公司 備案號:津ICP備19006588號-2 sitemap.xml 技術支持:制藥網(wǎng) 管理登陸
地址:天津市武清開發(fā)區(qū)創(chuàng)業(yè)總部基地五號樓